Die genomiese volgordes van die meeste virusse is bekend.Nukleïensuurprobes wat kort DNA-segmente is wat ontwerp is om met komplementêre virale DNA of RNA-segmente te hibridiseer.Die polimerase kettingreaksie (PCR) is 'n meer doeltreffende tegniek vir virale opsporing.Hoë deurset diagnostiese metodes is onlangs ontwikkel.
A. Nukleïensuurhibridisasietegniek
Nukleïensuurhibridisasie, wat hoofsaaklik Southern blotting(Southern) en Northern blotting(Noordelike) insluit, is 'n vinnig ontwikkelende nuwe tegniek in die virusdiagnostiese veld.Die rasionaal van die hibridisasie-toets is om kort segmente van DNA (genoem "probe") te gebruik wat ontwerp is om te hibridiseer met komplementêre virale DNA of RNA-segmente.Deur verhitting of alkaliese behandeling word dubbelstring-teiken-DNA of RNA in enkelstringe geskei en dan op 'n soliede ondersteuning geïmmobiliseer.Daarna word sonde bygevoeg en met die teiken DNA of RNA gehibridiseer.Aangesien die sonde met isotoop of nie-radioaktiewe nuklied gemerk is, kan die teiken DNA of RNA opgespoor word deur outoradiografie of deur die biotien-avidienstelsel.Aangesien die meeste virale genome gekloon en opeenvolgend is, kan hulle opgespoor word met behulp van virusspesifieke volgordes as probes in die monster.Tans sluit die hibridisasiemetodes in: dot klad, in situ hibridisasie in selle, DNA klad (DNA) (Southern klad) en RNA klad (RNA) (Noordelike klad).
B.PCR Tegnologie
In onlangse jare is 'n reeks in vitro nukleïensuur amplifikasie tegnieke ontwikkel gebaseer op PCR, om onsensitiewe of onkweekbare virusse te toets.PCR is 'n metode wat spesifieke DNA-volgorde kan sintetiseer deur in vitro polimerase reaksie.Die proses van PCR sluit 'n termiese siklus van drie stappe in: denaturering, uitgloeiing en verlenging By hoë temperatuur (93℃~95℃) word die dubbelstring-DNS in twee enkel-DNS-stringe geskei;dan by lae temperatuur (37℃~60℃), gloei twee gesintetiseerde nukleotied-primers aan die komplementêre DNA-segmente;terwyl die sintese van nuwe DNA-kettings by die toepaslike temperatuur vir Taq-ensiem (72℃) vanaf primer 3'end begin deur komplementêre DNA as sjablone en enkelnukleotiede as materiale te gebruik.So na elke siklus kan een DNA-ketting in twee kettings geamplifiseer word.Deur hierdie proses te herhaal, kan elke DNS-ketting wat in een siklus gesintetiseer is as sjabloon in die volgende siklus gebruik word, en die aantal DNS-kettings word in elke siklus verdubbel, wat beteken dat die produksie van PCR in 'n 2n log-spoed geamplifiseer word.Na 25 tot 30 siklusse word die produksie van PCR deur elektroforese geïdentifiseer, en die spesifieke DNA-produkte kan onder UV-lig (254nm) waargeneem word.Vir sy voordeel van spesifisiteit, sensitiwiteit en gerief, is PCR aangeneem in die kliniese diagnose van baie virale infeksies soos HCV, MIV, CMV en HPV.Aangesien PCR baie sensitief is, kan dit virus-DNA op fg-vlak opspoor, moet die operasie baie versigtig uitgevoer word om vals positief te vermy.Boonop beteken positiewe uitslag in nukleïensuurtoets nie dat daar lewende aansteeklike virus in die monster is nie.
Met wye toepassing van PCR-tegniek word nuwe tegnieke en metodes ontwikkel gebaseer op PCR-tegnieke vir verskillende toetsdoeleindes.Byvoorbeeld, die intydse kwantitatiewe PCR kan virale lading opspoor;in situ PCR word gebruik om virusinfeksie in weefsel of selle te identifiseer;Die geneste PCR kan die spesifisiteit van PCR verhoog.Onder hulle is intydse kwantitatiewe PCR vinniger ontwikkel.Baie nuwe tegnieke, soos TaqMan hidrolise sonde, hibridisasie sonde, en molekulêre baken sonde, is gekombineer in intydse kwantitatiewe PCR tegniek, wat wyd gebruik word in kliniese navorsing.Behalwe om die viruslading in pasiënte se liggaamsvloeistof akkuraat te identifiseer, kan hierdie metode ook gebruik word om dwelmverdraagsame mutant op te spoor.Daarom word intydse kwantitatiewe PKR hoofsaaklik toegepas in kuratiewe effek-evaluering en dwelmverdraagsaamheid-toesig.
C. Hoë-deurvloei opsporing van virale nukleïensure
Om in die behoeftes vir vinnige diagnose van nuwe opkomende aansteeklike siektes te voorsien, is verskeie hoë-deurvloei-opsporingsmetodes, soos DNA-skyfies (DNS), daargestel.Vir DNA-skyfies word spesifieke probes gesintetiseer en aan klein silikonskyfies in baie hoë digtheid geheg om DNA-probe-mikroskikking (DNA) te vorm wat met monster gehibridiseer kan word.Die sein van hibridisasie kan deur konfokale mikroskoop of laserskandeerder afgebeeld word en verder deur die rekenaar verwerk word en groot datastel oor verskillende gene kan verkry word.Daar is twee soorte DNA-skyfies.Die "sinteseskyfie" is soos volg: die spesifieke oligonukleotiede word direk op die skyfies gesintetiseer.Nog 'n DNA-poelskyfie.Die gekloonde gene of PCR-produkte word ordelik op die skyfie gedruk.Die voordeel van DNS-skyfietegnologie is die gelyktydige opsporing van 'n groot hoeveelheid DNS-volgordes.Die nuutste weergawe van patogeen-opsporingskyfie kan meer as 1700 menslike virusse gelyktydig identifiseer.DNA-skyfietegnologie het die probleme van tradisionele nukleïensuurhibridisasiemetodes opgelos en het baie wye toepassings in virale diagnose en epidemiologiese studie.
Postyd: 23 Desember 2020